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生物技术学 植物物种鉴别中核基因条形码技术应用

博今文化 / 2020-03-25

  摘要:DNA条形码是应用一个或几个短的规范DNA片段,对物种停止快速精确审定的一种分子标志技术。核基因条形码序列具有进化速率快,长度激进,进化分歧等优点,被普遍应用于植物分类、进化及亲缘关系剖析等方面研讨。单拷贝核基因序列进化速率中等,能够直接辨别直系同源和旁系同源,没有内部反复,也没有明显的核苷酸倾向性,在研讨植物分类和进化方面表现出较大优势,主要被用于物种间的亲缘关系及演化史、多倍体植物物种构成及系统关系剖析、多倍体物种基因谱系的来源剖析、多倍体物种的基因渗入现象等;多拷贝核基因序列在一些植物物种中可能与物种的早期分化联络更为严密,较叶绿体DNA条形码更便于辨别近缘物种,被普遍应用于被子植物科内、属内、属间关系系统发育研讨,并用于药用植物及混伪品的鉴别剖析。本综述主要概括总结了单拷贝核基因、多拷贝核基因ITS和ITS2序列在植物中的研讨停顿,讨论了核基因条形码目前研讨存在的问题,并对今后的开展前景停止了瞻望。

  关键词:核基因条形码; 物种审定; 单拷贝核基因; ITS;

  DNA条形码是应用基因组中一段或几段短的规范DNA片段停止物种辨认和审定的技术(Hebert et al.,2003;Kress et al.,2005)。能够处理形态分类极易混杂的难题,辨认难以辨别的隐秘种,而且可对非完好的生物标本停止审定,是传统形态分类与物种审定的强有力补充(罗亚皇等,2013)。

  目前,叶绿体基因组的rbc L、mat K、trn H-psb A和核基因组的ITS片段被引荐作为多数高等植物的DNA条形码(Kress and Erickson,2007;CBOL Plant Working Group,2009;China Plant BOL Group,2011)。但由于叶绿体基因组进化较慢,约为核基因组进化速率的一半,开发出来的DNA条形码审定率相对较低,从而限制其在较低分类阶元(如属,亚属)中的应用(Wolfe et al.,1987)。单拷贝核基因序列进化速率中等,能够直接辨别直系同源和旁系同源,没有内部反复,也没有明显的核苷酸倾向性,在研讨植物分类和进化方面表现出较大优势(杨晨阳等,2018);多拷贝核基因序列如ITS、ITS2等在一些植物物种中可能与物种的早期分化联络更为严密,较叶绿体DNA条形码更能有效辨别近缘物种(China Plant BOL Group,2011;Wang et al.,2011)。本综述主要对单拷贝核基因、多拷贝核基因ITS和ITS2序列的研讨停止概述,以期对核基因序列在植物中的物种审定和系统发育学研讨提供理论参考。

  1 单拷贝核基因序列在植物中的应用

  1.1 亲缘关系及系统发育剖析

  单拷贝核基因(single copy nuclear gene,scnDNA)是指基因组中拷贝数只要1个或几个拷贝的核基因,大多数属于管家基因。单拷贝核基因属于双亲遗传并能提供大量信息位点,并具有直系同源、易于扩增测序等优点,只在物种分化时才发作别离,能够更好反映物种的进化史。越来越多的研讨发现,单拷贝核基因能够愈加高效的用于植物的分子系统学剖析。目前单拷贝核基因序列主要被用于物种间的亲缘关系及演化史、多倍体植物物种构成及系统关系剖析、多倍体物种基因谱系的来源剖析、多倍体物种的基因渗入现象等。

  单拷贝基来由于不存在多拷贝,变异信息丰厚,具有更高的测序胜利率,在讨论物种间的亲缘关系和系统发育剖析上具有较大优势。Michael等(2001,第九届国际苏铁生物学大会,pp.21)经过测定Cy-AG-AM(CycasAgamous)、PEX4、PMP22和ATG2等4个单拷贝核基因的分子序列,剖析泽米铁属植物之间的亲缘关系,并应用生物天文学和宏观形态学比拟的办法讨论了基于上述基因片段树立的泽米属的主要支系和新树立的亲缘关系。Joly等(2006)开发了单拷贝基因GAPDH作为蔷薇属植物的核基因标志。Duarte等(2010)发现杨属、拟南芥属、葡萄属和稻属4个属植物之间共享的959个单拷贝核基因。这些单拷贝基因也被应用于杨柳科(Du et al.,2014)、山龙眼科(Tonnabel et al.,2014)等多种植物的系统关系研讨中,为单拷贝核基因DNA条形码的挑选提供了根据。Lu等(2014)应用LFY和NLY两个单拷贝核基因,重建了裸子植物的系统发育过程,结果标明LFY和NLY序列能够用来剖析裸子植物的科间系统发育关系和属间亲缘关系。王凡红(2014)选取了3个单拷贝核基因(IBR3_2,DETl和SQD1_1)停止实验,其中IB-R3_2基因的PCR扩增率接近100%,但测序胜利率不理想,目前仅在鞭叶铁线蕨系停止了后续剖析。赵奉彬(2016)对中国杨属17个代表种69个样本选取核基因组单拷贝片段DSH10、DSH28停止DNA条形码研讨,剖析结果标明单拷贝核基因DSH10和DSH28的物种辨别才能较好,效果明显优于叶绿体片段,证明核基因片段关于审定杨属物种更为合适。李建芳等(2017)发现单拷贝核基因RR255与R257可用作地黄专用审定条形码。杨晨阳等(2018)以应用单拷贝核基因GAPDH对蔷薇属植物的遗传多样性停止剖析,构建了基于GAPDH基因的系统发育树,结果标明基于GAPDH基因的分类结果与现有蔷薇属分类结果有较大差别,如芹叶组和桂味组并未构成单系类群,可能与基因交流有关。单拷贝基因在剖析植物亲缘关系和讨论系统发育上具有良好效果,但是局部植物的分子分类结果与传统形态分类结果显现出较大差异,剖析发现可能是在物种间基因停止了重新组合的缘故。

  1.2 物种来源和系统演化

  在提醒物种来源、重建杂交物种构成过程时,叶绿体基由于单亲遗传,无法为杂交来源提供根据,多拷贝核基来由于协同进化等缘由,可能提供不牢靠信息,而单拷贝基来由于不存在协同进化,具有父母双方的遗传信息,在提醒物种来源上具有不可取代的作用。Wang等(2014)应用24个单拷贝核基因序列,剖析了杨树的系统发育关系,揣测了杨树杂种的来源。唐政(2014)应用9个单拷贝核基因(SCNGs),对27份柑橘属及其近缘种的演化停止研讨,提醒了柑橘属及其近缘种的亲缘关系和演化历史,为进一步应用单拷贝基因剖析研讨柑橘属系统演化提供协助。董山平(2015)克隆测序取得单拷贝核基因Leafy、RPB2等序列,并构建系统发育树,剖析榆叶梅与其它近缘种的亲缘关系,研讨发现矮扁桃、榆叶梅、长柄扁桃为一个类群,‘紫烟’榆叶梅可能为杂交来源,其父母本可能一方来自榆叶梅,另一方来自山桃或中国李或其它近缘种。单拷贝基因在研讨物种来源进化上提供了重要根据,应用单拷贝基因剖析植物与近缘种的亲缘关系及演化历史、提醒杂种来源,将为系统演化提供理论根据。

  1.3 物种界定及遗传变异剖析

  传统的物种界定主要依赖于形态特征,但杂交给物种界定带来了宏大艰难,传统分子标志仅仅从基因频率角度停止聚类剖析,常常疏忽了建树剖析,而由于物种杂交,招致叶绿体基因在种间共享,形成其在物种界定剖析中的失败,单拷贝核基因基因组中只要一个成员,且直系同源,在物种界定和遗传变异剖析方面起到了重要作用。余双炳(2015)应用单拷贝核Pgk1基因讨论东亚、中亚以及青藏高原、欧洲4个冰草(A.cristatum)居群对不同环境所发作的进化;基于Nei's的基因分化系数标明居群内变异是冰草物种的主要变异来源。并分离地质历史事情,剖析了其进化成因。杜淑辉等(2016)对4个欧洲山杨自然居群72个个体的6个单拷贝核基因标志(sing-copy nuclear markers)停止扩增与测序,并停止生物信息学剖析,研讨中国新疆地域欧洲山杨自然居群的遗传多样性与遗传分化程度。遗传多样性指数为0.73,标明欧洲山杨表现出较高的遗传多样性程度;AMOVA剖析标明山杨居群间表现出较低的遗传分化程度,遗传变异主要存在于居群内。陈君(2017)发现可应用在白栎组(Section quercus)中开发的19个单拷贝核基因序列,停止白栎组系统发育关系研讨,并能够对白栎组停止较好的物种界定。结果标明白栎组物种以南北为界线分为两支。除枹栎外节点的后验概率都不高,可能缘由是共享祖先多态或基因渐渗的结果。单拷贝核基来由于能够直接辨别直系同源和旁系同源,进化速率更快,序列更为丰厚,目前在植物亲缘关系剖析、物种进化、多倍体物种来源剖析等方面获得了良好停顿,但由于多数植物的基因组信息不够丰厚,单拷贝核基因还不能作为通用的DNA条形码序列,随着基因组新一代测序的开展,越来越多的单拷贝将被发掘出来,将为单拷贝核基因的挑选提供有效根据。

  2 ITS序列在植物系统发育和混伪品审定中的剖析

  2.1 属间关系系统发育剖析

  ITS即nrDNA的内转录距离区,为rDNA基因中5.8S rDNA和28S rDNA基因距离序列,具有序列高度变异性、长度激进性、分歧进化、进化速率快等优点,可提供详尽的、系统学剖析所需的可遗传性状,主要被普遍应用于被子植物科内、属内、属间关系系统发育,以及一些混伪品的审定研讨(Powerse et al.,1997)。

  ITS序列由5.8S、ITS1和ITS2组成,进化速度较快,被普遍应用于植物属间的系统发育剖析,提醒植物与其近缘属之间的亲缘关系。Hodkinson等(2000)运用ITS序列和AFLP标志分离的办法比照研讨了刚竹属、方竹属、倭竹属、唐竹属、新小竹属35个竹种的系统发育关系。Guo等(2001)以高山竹筱竹属复合群及其近缘属箭竹、玉山竹属和悬竹属等不同类群为资料,应用ITS核糖体DNA内转录距离区序列剖析了ITS序列在界定竹类植物属间的牢靠性。姚娜等(2014)对8个牧草物种共22个种类停止ITS扩增并测序。ITS的扩增胜利率和物种审定胜利率均到达100%,同源性剖析标明物种间变异位点多、变异显著,标明ITS序列能够作为审定牧草的DNA条形码。成宇等(2018)对贵州省19科26属30种林木树种植物ITS序列停止PCR扩增及测序,并计算了种内、种间遗传间隔,构建了系统发育树。结果得出ITS序列对30种林木树种的审定胜利率为83%,ITS序列可作为林木树种DNA条形码的候选序列。王苗苗等(2018)应用ITS序列对竹亚科13个属76个竹种停止DNA条形码分子审定,剖析结果显现,种内遗传间隔远小于种间遗传间隔,ITS序列可用于竹类资源的物种审定研讨。在以上植物属间关系研讨中,ITS序列均到达了较高的扩增胜利率和物种审定效率,种内遗传间隔小、种间遗传间隔大、变异位点多、变异显著,较好地提醒了植物属间的亲缘关系。

  2.2 属内关系系统发育研讨

  ITS序列由于在植物较低分类阶元上核苷酸序列的长度激进和高度变异,可提供的遗传性状较为详尽,在剖析属内亲缘关系上也应用颇多。Li等(2012)以国产63种榕属植物为研讨对象,剖析DNA条形码在榕属植物中的的审定效果。研讨标明,ITS片段能够胜利地分辨出其中45种,物种分辨率达75%。付涛等(2015)采用ITS序列对11株野生樱属植物停止分子审定,剖析得出ITS种间变异水平较大,可作为审定樱属植物的规范条形码。钟浩等(2016)应用核糖体基因(nrDNA)的内转录距离区(ITS)序列对9个茶竿竹亚属竹种停止了剖析,讨论了怀集县铁厘茶竿竹和白水茶竿竹与其它茶竿竹亚属竹种之间在分子程度上的差别以及它们的分类位置。付涛等(2018)以30种典型樱属植物为实验资料,对其ITS序列停止测序剖析并构建系统发育树,研讨结果进一步肯定了ITS序列能够作为审定樱属植物的中心条形码序列。覃瑞等(2019)应用ITS序列剖析,提醒了9种乌头属植物之间的亲缘关系。ITS序列在剖析属内种间的亲缘关系上起到了良好的效果,经过测序剖析和系统发育树构建,讨论了植物在分子程度上的差别及其分类位置,可为传统分类作强有力的补充。

  2.3 与近缘植物的辨别及混伪品的审定研讨

  ITS由于进化速度快,变异水平高等特性,也适用于与近缘种的辨别和混伪品的审定研讨。吴劲松等(2014)对41份白及属药用植物样品基因组DNA的nrDNA ITS停止扩增、测序及序列剖析,比拟物种种内种间的变异,并评价不同序列的审定才能。结果显现,白及属物种nrDNA ITS种间变异(0.022~0.106)明显大于种内变异(0~0.012),NJ树也能精确地域分4个物种。结果标明,nrDNA ITS序列能够精确审定白及属及其混伪品,是合适白及属药用植物的DNA条形码。杨丽莹等(2016)对来自不同产地的28份落葵薯及其近缘植物的核基因ITS序列停止PCR扩增并测序,ITS序列种内和种间间隔在Barcoding gap检验中明显别离;NJ树标明ITS序列可辨别落葵薯及其近缘植物。夏至等(2014)经过ITS序列扩增和剖析,评价了其对黄芩及其同属近缘种(易混品)的鉴别才能。夏至等(2016)对地黄属物种的ITS序列扩增和测序,比拟各序列在种内和种间变异,并用最近间隔法、类似性搜索法、构建Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树等办法停止审定剖析。ITS序列的种内变异均小于种间变异。在NJ树上,地黄的一切样品与茄叶地黄聚在一支,支持率为96%,标明ITS序列可用于审定中药材地黄与同属近缘种。

  ITS在植物与其近缘种的辨别上具有重要的鉴别意义,应用ITS序列可对植物及近缘种停止快速精确的审定;而ITS在药用植物及混伪品中的胜利鉴别,也为药用植物审定提供了科学根据和理论根底。

  在许多亲缘关系较为亲密的植物中,其ITS序列长度接近,但有一定变异,所以ITS序列能够应用于植物较低阶元的亲缘关系研讨和系统发育剖析,ITS序列在属间关系、近缘种的亲缘关系剖析、种下等级划分等方面研讨获得了较大停顿。但由于一些植物如裸子植物的ITS序列长度较长,给序列扩增和测序工作带来很大难度,在实践操作中主要选取ITS序列中较为激进的区域停止亲缘关系剖析和审定研讨。

  3 ITS2序列的应用

  3.1 用于科及属内植物的审定

  作为nrDNA的内转录距离区(ITS)序列的一局部,ITS2具有序列长度短,易于扩增等特性,且ITS2二级构造辨别度较高,审定范围较广,在进步构建系统发育树的精确性方面起重要作用(费希同等,2014)。ITS2进化速度较快,核苷酸序列变异大,可用于科内、属内、属间等的审定,是药用植物审定混伪品的通用条形码,但主要为属以下程度提供丰厚的变异位点和信息位点。

  Chen等(2010)最早应用内转录距离区(ITS2)对6 600份植物剖析,开启了ITS2应用于植物审定研讨的先河。研讨得出ITS2序列具有较高的审定胜利率,推断能够作为植物审定的规范DNA条形码序列。Pang等(2010)以蔷薇科96个属的893种植物中采集的1 410份样品为研讨对象,对4个DNA条形码序列停止了扩增和序列剖析,发现ITS2序列用于鉴别蔷薇科植物的效果最好。王晓明等(2012)应用通用引物对以9种中药鸡骨草的ITS和ITS2序列停止PCR扩增,遗传间隔和建树结果均标明ITS2序列合适作为豆科植物的DNA条形码,可为豆科植物种间鉴别提供根据。宋炳轲等(2014)应用ITS2序列对60份大麻原植物停止PCR扩增,测序后停止序列剖析。结果显现一切样本的ITS2扩增片段序列完整分歧,标明ITS2序列不合适用于审定大麻属植物。俞超等(2014)从8个贝母属21个样品中提取了基因组DNA,停止了ITS2序列的PCR扩增和测序,测序结果标明ITS2序列审定胜利率为100%,种内及种间遗传间隔分别为0.000 5和0.046 8,且种内高度激进;系统发育树构建结果显现ITS2序列所构建的系统发育树精确度较高。标明ITS2序列能够用作审定贝母属植物的通用条形码序列。张忠廉等(2015)研讨发现ITS2序列能精确鉴别千斤拔属药用植物,可用于千斤拔药材基原植物DNA条形码审定研讨。张艳艳等(2016)对5种木瓜属药用植物的19个样本ITS2序列停止PCR扩增和测序,计算其种间、种内的Kimura 2-parameter(K2P)间隔,及各序列变异位点并构建系统发育树,并预测ITS2二级构造。结果ITS2序列间存在明显差别,构建的系统发育树显现ITS2序列能很好地将5种植物辨别,显现出单系性;5种植物的ITS2二级构造存在明显差别。标明ITS2序列能够有效鉴别5种木瓜属植物。应用ITS2序列对不同植物物种停止剖析,依据序列的差别,并分离系统进化树的结果,能够明晰地推断出各物种之间亲缘关系的远近,从而到达良好的鉴别效果。但在大麻属植物审定中ITS2扩增片段序列完整分歧,标明在大麻属植物中ITS2序列为高度激进,所以呈现了审定失败的现象。

  3.2 药用植物及混伪品的鉴别剖析

  ITS2用于鉴别药用植物及其混伪品具有良好的反复性和稳定性,被列为鉴别药用植物首选DNA条形码。石林春等(2014)应用ITS2条形码对天南星及其混伪品7种58份样品停止审定剖析。结果标明异叶天南星、东北天南星和天南星3种基原的种内K2P间隔均小于其种间K2P间隔,在NJ树上天南星3种基原分别聚为独立的支。天南星3种基原与天南星混伪品聚为不同的支。标明ITS2能够作为审定天南星3种基原及其混伪品的DNA条形码。周建国等(2016)经过剖析裂叶荆芥及其混伪品的ITS2条形码序列,用软件MEGA6.0对扩增取得的ITS2条形码序列停止相关数据剖析,对裂叶荆芥及其混伪品间的种间序列差别停止剖析比拟,计算其种间、种内K2P遗传间隔,并构建邻接树。裂叶荆芥ITS2序列高度激进,种内无变异位点。裂叶荆芥与其混伪种类间变异位点较多,种间K2P最小间隔为0.017 5,大于其种内间隔,NJ树显现能够将裂叶荆芥与其混伪品完整分开。结果标明ITS2序列可作为鉴别荆芥、荆芥穗及其混伪品的新办法,为荆芥的种质资源审定提供了新的技术手腕。经过ITS2序列的遗传间隔剖析和聚类结果标明,ITS2序列能够快速审定药用植物及其混伪品,但想肯定ITS2序列能否可在更大范围内通用,需求进一步扩展植物标本的采集范围和数量。

  3.3 用于植物及其近缘种的鉴别剖析

  ITS2不只是区别植物与混伪品的重要手腕,还能够较为精确地剖析植物与其近缘种之间的系统发育关系,对植物系统分类具有重要意义。为精确审定柴胡与大叶柴胡,于俊林等(2014)以48份柴胡、大叶柴胡药材为资料,扩增ITS2序列并停止测序,采用CodonCode Aligner、MEGA5.0等软件停止剖析比对,基于K2P模型停止遗传间隔剖析,并构建系统发育树,结果显现柴胡与大叶柴胡种间最小K2P间隔远大于柴胡种内最大K2P间隔。NJ树显现大叶柴胡与柴胡的关系较远,能够明显辨别开来。朱珣之和高婷(2014)应用ITS2序列来讨论其17种常见入侵植物与36种近缘物种中的审定才能。结果标明,ITS2序列在入侵物种及其近缘物种间存在明显的遗传差别,种内变异小于种间变异,在入侵植物与其近缘物种中审定胜利率达95.5%。构建的NJ树能够很好地显现各不同入侵植物物种的聚类。此外,ITS2的二级构造也具有一定的系统学及分类学意义。因而,ITS2条形码序列可以作为入侵植物分子审定的有力工具,具有重要的应用价值。吕泽芳等(2015)应用ITS2条形码序列讨论其对木瓜及近缘物属植物审定的可行性。结果标明,ITS2条形码可以快速审定木瓜属及其近缘属植物。ITS2序列由于长度短、易扩增、具有较高的审定胜利率等特性,被以为是审定药用植物及其混伪品的规范DNA条形码序列,而上述研讨结果标明,ITS2序列在辨别植物及其近缘种方面,也起到了重要作用,能够很好地将植物及其近缘种辨别开来。

  ITS2序列由于序列长度短,进化速率快,变异位点较多,在大多数植物的审定中具有良好效果,目前曾经被认定为是鉴别药用植物的最佳序列。但由于ITS2属于多拷贝核基因,在PCR扩增中会存在偏好性等问题,招致审定结果不理想以至失败,能够采用与其他DNA条形码序列相分离的办法,更好地完成植物亲缘关系及系统发育等研讨。

  4 瞻望

  目前核基因条形码由于进化速度快,在植物进化、分类及物种审定等方面应用普遍,能够用于许多植物的剖析审定,但也存在不少审定不理想或失败的状况。如由于目前大多数植物缺乏基因组信息,单拷贝核基因条形码的通用性较差(李建芳等,2017)。而多拷贝基因,由于PCR扩增的偏好性和致同进化不完整等,易招致系统发育关系的不肯定性(胡兆锋等,2013)。同时,还短少对更大样本量的研讨来肯定核基因条形码的审定效率。

  随着新一代测序(Next generation sequencing)技术的迅猛开展,许多植物全基因组序列开端陆续测定完成,从大量的测序信息中大范围获取核基因序列,使得开发不同物种通用的核基因条形码成为可能。同时扩展标本植物的采集范围和数量,愈加精确地肯定核基因条形码的审定效率。叶绿体基因受选择的压力大,相对愈加激进,采用叶绿体条形码和核基因条形码多片段相分离的计划,将更好地辨认和审定物种。同时分离经典分类的研讨结果,能够使得物种审定工作愈加高效、精确,为植物的系统演化及分类研讨提供重要根据。